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反相高效液相色谱

* 来源: 互联网 * 作者: sainaer * 发表时间: 2022-07-20 9:36:52
RP-HPLC 越来越多地应用于蛋白质的分离,主要包括分析型和制备型。但如果要求纯化过的蛋白能够恢复活性并重新折叠为正确的三维结构,则不建议使用 RP-HPLC,因为许多蛋白在有机溶液中会发生不可逆变性。反相支持物(骨架)上的蛋白分析也会碰到低的回收率、畸形峰、「鬼峰(ghosting)」(即某个蛋白峰在进行下次色谱分析时虚假地再次出现)等问题。


反相高效液相色谱是由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系,它正好与由极性固定相和弱极性流动相所组成的液相色谱体系(正相色谱)相反。RP-HPLC的典型的固定相是十八烷基键合硅胶,典型的流动相是甲醇和乙腈。RP-HPLC是当今液相色谱的最主要的分离模式,几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物的分离。 反相色谱法适于分离非极性、极性或离子型化合物,大部分的分析任务皆由反相色谱法完成。
反相高效液相色谱是化学键合相色谱法的一种。化学键合相色谱法是由液液色谱法发展起来的,是为了解决在分离过程中,机械吸附在载体上的固体液的流失问题而发展出来的一种新方法。键合相色谱法通过将不同的有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶载体表面的游离烃基上,而生成化学键合固定相,化学键合固定相对各种极性溶剂都有良好的化学稳定性和热稳定性。由它制备的色谱主柱效高、使用寿命长、重现性好,几乎对各种类型的有机化合物都呈现良好的选择性,并可用于梯度洗脱操作,消除了分配色谱法的缺点。
根据键合固定相和流动相相对极性的强弱,可将键合色谱法分为正相键合色谱法和反相键合色谱法。反相键合色谱法即反相高效液相色谱。在正相键合色谱法中,键合固定相的极性大于流动相的极性,适用于分离油溶性或水溶性的极性和强极性化合物。在反相键合相色谱法中,键合固定相的极性小于流动相的极性适用于分离非极性、极性或离子型化合物,其应用范围也比正相键合相色谱法更广泛。

原理

在反相键合相色谱法中使用的是非极性键合固定相。它是将全多孔(或薄壳)微粒硅胶载体,经酸活化处理后与含轻基链(C4、C8、C18)或苯基的硅烷化试剂反应,生成表面具有烷基或苯基的非极性固定相。如共价结合到载体上的直链碳氢化合物正辛基等。关于反相色谱的分离机理,吸附色谱的作用机制认为溶质在固定相上的保留主要是疏水作用,在高效液相色谱中又被称为疏溶剂作用。根据疏溶剂理论,当溶质分子进入极性流动相后,即占据流动相中相应的空间,而排挤一部分溶剂分子。当溶质分子被流动相推动与固定相接触时,溶质分子的非极性部分或非极性因子会将非极性固定相上附着的溶剂膜排挤开,而直接与非极性固定相上的烷基官能团相结合(吸附)形成缔合络合物,构成单分子吸附层。这种疏溶剂的吸附作用是可逆的,当流动相极性减少时,这种疏溶剂斥力下降,会发生解缔,并将溶质分子解放而被洗脱下来。 [1] 

影响溶质保留值的三个因素

烷基键合固定相对每种溶质分子缔合作用和解缔作用能力之差,就决定了溶质分子在色谱过程的保留值。以下简述影响溶质保留值的三个因素:
1)溶质分子结构
在反相键合相色谱法中,溶质的分离是以它们的疏水结构差异为依据的,溶质的极性越弱,疏水性也强,保留值越大。根据疏溶剂理论,溶质的保留值与其分子中非极性部分的总表面积有关,其与烷基键合固定相结出的面积越大,保留值越大。
2) 烷基键合固定相的特性
烷基键合固定相的作用在于提供非极性作用表面,因此键合到硅胶表面的烷基数量就决定着溶质容量因子的大小。烷基的疏水特性随碳链的加长而增加,溶质的保留值也随着烷基碳链长度的增加而增大。随着烷基碳链的增长,增加了键合相的非极性作用的表面积,其不仅影响溶质的保留值,还影响色谱柱的选择性,即随烷基碳链的加长其对溶质分离的选择性也增大。
3) 流动相性质
流动相的表面张力愈大,介电常数愈大,其极性越强,此时溶质与烷基键合相得缔合能力越强,流动相的洗脱强度弱,导致溶质的保留值越大。