服务热线:0510-83786900
当前位置:新闻动态

高效液相色谱仪泵的维护与操作

* 来源: 互联网 * 作者: sainaer * 发表时间: 2022-06-08 9:33:14
泵是液相色谱的核心,泵将流动相从溶剂瓶输送到液相流路系统中,并要在高压下保持流量 和压力的稳定。泵的状态正常是液相色谱准确分析的基础,所以平日一定要重视对泵的维护。 下面就安捷伦 1100/1200 液相色谱泵的日常维护进行简要的介绍。 
流动相的准备 为了防止颗粒性物质对泵组件的磨损,流动相(特别是水相)应该新鲜配置并且过滤。上机 前对流动相进行适当的超声脱气,以保证更好的在线脱气和在线混合的效果。
2.比例阀溶剂通道的分配 四元泵的比例阀有 A、B、C、D 四个通道,建议将盐溶液接在下面的通道(A 或 D),将有 机溶剂接在上面的通道(B 或 C)上,也就是有机通道最好在盐溶液通道的上面。且建议用 水定期冲洗所有比例阀通道除去可能在阀口析出的盐结晶。
3.过滤白头的维护 过滤白头位于排气阀内,是一种聚四氟乙烯材质的微孔过滤芯,用于过滤流动相中的微粒, 是经常需要维护的地方。当系统压力有异常增高时,首先需要检查过滤白头是否阻塞了。判 断的方法是:打开排气阀,以纯水作流动相,将流速设为 5mL/min,如果泵压超过 10bar, 则说明过滤白头需要更换了。对过滤白头的预防性维护通常可以是 1~2 个月更换 1 次,更换 时同时检查一下过滤白头前面的密封金垫,如果发现变形,也应及时更换。 如果过滤白头 更换过于频繁,则需要认真检查一下流动相的品质,确保流动相上机前过滤,确保使用了合 适的过滤膜。如果流动相有长菌现象,除了配置新的溶剂,还应对相应的溶剂管线和脱气机 通道进行彻底的清洗。
4.柱塞杆与柱塞密封圈的维护 柱塞密封圈套在柱塞杆上用于隔离泵与外界,工作时,它和柱塞杆进行频繁的往复摩擦,使 用一段时间后,会有一定的磨损,因而密封圈需要定期更换以保证系统的密封性。更换活塞 密封垫时检查活塞杆上是否有划痕。有划痕的活塞将导致轻度渗漏,并降低密封垫的使用寿 命。应尽早更换有划痕的活塞。 柱塞密封圈有反相和正相之分,反相密封圈为黑色,石墨 Teflon 材质;正相呈橘黄色,聚 乙烯材质,更适用于正相溶剂。1100/1200 标配的是反相密封圈,正相应用时,需要更换为 正相密封圈。 盐溶液对柱塞密封圈的寿命有着很大的影响,使用有盐溶液作为流动相的体系时,要注意盐 溶液通道的清洗,千万不能让盐溶液在系统中过夜,常常一个晚上析出的盐粒就会造成系统 堵塞,对泵产生较大的损害。为了延长密封圈和柱塞杆的寿命,在经常使用较高浓度的缓冲 盐溶液的情况下,建议安装柱塞清洗附件。柱塞清洗的原理在于:柱塞泵在工作时,虽然有 密封圈密封,但由于毛细作用,还是会有一些流动相渗入到密封圈与柱塞杆之间。如果流动 相中有缓冲盐,当柱塞杆壁上的溶剂挥发掉后,极细小的盐粒留了下来。这样的盐粒就象砂 纸一样磨损着柱塞杆和柱塞密封圈,会大大降低柱塞杆和密封圈的寿命。柱塞清洗附件是在 柱塞杆的中间加入了一个可以有水流过的腔体,通过水不断的流动,就可以带走渗进来的盐 溶液,防止了盐粒的析出,保护了柱塞杆和柱塞密封圈。通常我们往柱塞清洗的水里加入 10%的异丙醇,可以减小水的张力,便于清洗液流动,并且抑制长菌。但有一点要注意的是, 装有柱塞清洗附件的泵头,清洗液流量可以很小(如没分钟几滴),但一定不要让清洗通道 里干涸,如果水流光了,应该尽快换上新的溶液。否则会减少柱塞杆和密封圈的寿命。
5.主动阀的维护 主动阀是流动相进入泵体的门户。如果我们发现流量为零,流量不稳,或泵压波动特别大, 常常都是因为主动阀漏或是堵了。主动阀里面装有一个小的[wiki]单向阀[/wiki]芯,我们将 其取下,在异丙醇内超声清洗一下,一般能解决这样的问题。如果超声不能解决问题的话, 可以更换该阀芯。对于经常使用缓冲盐体系的用户,手头常备一个这样的阀芯是非常有用的, 往往可以及时解决问题,大大的降低停机带来的损失。
6.出口阀的维护 出口阀内部也有,如果有盐粒或其它杂质渗入其中,也会造成出口阀的堵或漏,常常表现为 压力的异常波动。通常我们可以用异丙醇或 60 度左右的热水冲洗系统,如果无效,在异丙 醇中超声清洗它常常会解决这样的问题。 输液泵的常见故障及对策 输液泵/高压泵是保证 HPLC 系统流路畅通、流量精确和压力稳定的重要仪器部件,目 前多用往复式恒流柱塞泵,主要由柱塞杆、密封垫圈和两个单向阀组成,用马达带动凸轮驱 动柱塞杆作吸液和排液的往复运动。常分为单柱塞泵、并联柱塞泵、串联柱塞泵和柱塞隔膜 泵等类型。流动相混合方式分为低压混合和高压混合。常见泵的故障主要有以下几种,并提 供解决的办法。

 2.1 单向阀故障 由于球与阀座密封不严,液体倒流,造成压力不稳,甚至球与阀座粘在 一起阻死。密封不严主要是污染或气泡引起,球与阀座粘连也是由于污染和磨损造成。 为避免单向阀中的宝石球和阀座被污染,流动相应使用 HPLC 级的溶剂,并且配好的 流动相一定要用 0.45u 滤膜过滤和脱气。如果泵被微粒污染,可分别用水、甲醇、异丙醇、 二氯甲烷依次冲洗。冲洗时应打开泄液阀,最后再用所用的溶液冲洗整个系统。 气泡进入阀中会紧贴在阀体的一侧,使宝石球难返回到阀座,引起倒流,泵的压力和 流速会明显改变。此时,应立即打开泄液阀,大流量(2ml/min)冲洗泵,直至排除液为直 线型。因为甲醇可润湿泵内壁,挤出气泡,故也可使用脱过气的甲醇冲洗泵。长期不用的泵 或新装的泵头应该用甲醇赶气泡。泵进气泡也可在泵头上排气泡,即用扳手固定住进气泡的 泵头,拧开输出管道的压帽,手动泵送液,可见到气泡从孔中挤压出来,直至无气泡排出将 压帽拧紧[3]。 采取上述办法仍不能使压力稳定,应考虑是否密封垫坏了?或单向阀磨损、球不光滑 等,需更换部件。

2.2 泵垫圈故障 泵垫圈常见的故障是渗漏和垫圈受损污染系统。液相色谱系统一般情况 下不要使用强酸强碱溶液,因为这会损坏密封垫和柱塞杆。密封垫圈与运动着的柱塞杆紧密 接触,可使柱塞在泵头自由运动而流动相不漏出来,它是液相色谱系统中最易磨损的部件。 有条件的实验室可三个月更换一次垫圈,防止泵系统污染。如果用缓冲盐作流动相则更会加 速垫圈的磨损,应及时冲洗。当垫圈损坏时,表现为:泵压力不稳、泵头漏液。一旦出现这 个现象,应尽快更换新垫圈。 为避免上述故障的发生,我们在分析工作中应注意以下几点: ① 使用超纯水(18MΩ.cm)、纯度级别较高的试剂和色谱级溶剂配制流动相; ② 配好的流动相一定要抽滤脱气,即便仪器有在线脱气装置,也最好在上机前进行抽 滤。真空抽滤既过滤颗粒也脱了气泡,非常有效。 ③ 泵在起动前一定要通过泄液阀抽净泵里的空气。 ④ 用缓冲盐洗脱时,分析结束后一定要用水冲洗泵和整个流路系统,不要让腐蚀性溶 液滞留泵中,最后用有机溶剂充满系统。 3 色谱分离柱的使用与维护 在前述仪器工作原理部分,我们已经指出,液相色谱仪的分离是在色谱分离柱中实现 的。我们目前工作中多采用反相色谱柱,如何保护好分离柱减少柱的污染是延长柱寿命的关 键。 

3.1 怎样维护好色谱分离柱 加保护柱(预柱)是保护分离柱的有效办法。保护柱是根内装填料与分离柱性质相近 的短柱,接在分离柱之前,或代替流路过滤器。保护柱的作用是收集和阻塞分离柱口的化学 垃圾,这些垃圾如果直接进入分离柱会逐渐堆积在柱头,最终降低柱效能。保护柱是消耗品, 如分析血浆样品,一般分析 50 个样品后需更换新柱芯。 避免高压冲击分离柱。一般色谱柱都能承受得起高压,但经不住突然变化的高压冲击, 这将改变柱床体积,影响柱效。引起高压冲击的原因主要有:进样器的样品阀的缓慢转动、 泵启动太快、柱切换等操作。用手动进样阀时的压力变化不大,自动进样阀由于切换较慢, 可能会造成压力冲击。 合理选择分离柱。我们知道,选择色谱分离柱主要根据两点,一是根据待测组分的分 子量的大小;二是根据流动相条件,包括 PH 值、离子强度和溶剂极性等。传统硅胶基质的 键合相柱要求流动相 PH 值在 3-7 之间,极端 PH 值(>8)的流动相能溶解硅胶,使键合相 流失。而目前利用先进的杂化颗粒技术研制的高纯硅胶颗粒填料(如 Waters 公司的 XTerra 色谱柱),集硅胶和多孔聚合物填料的优点为一体,使有机硅烷单元取代了相当一部分占据 颗粒内部和表面位置的硅羟基,使这种新型填料具有分辨率高、稳定性强、PH 范围宽(1-12) 的优势,其性能突破了传统高效液相色谱柱的极限。所以一定要根据分析的对象、流动相的 条件选择合适的分离柱,茫然时可向公司的技术人员咨询。 定期冲洗分离柱。每次分析工作结束时,冲洗完缓冲盐后,最后要过度到用强溶剂冲 洗柱子,如可用色谱纯甲醇、乙腈冲洗反相 C18 柱,目的是冲去吸附在柱上的强保留组分。 如果用甲醇/水为流动相也应这样冲洗柱子,在一定程度上可恢复柱效。
 
3.2 怎样减少柱的污染? 最有效的办法是纯化样品。我们在多年的分析工作中发现,凡是样品纯化的越干净, 分离柱的寿命就越长;反之,只有提取没有纯化的样品,分离柱柱效下降较快。建立一个理 想的色谱分析方法应该有一套有效的样品前处理方法,特别是在分析血浆和尿液样品时,要 特别注意样品的提取与纯化,尽量使处理过的样品中杂质(如大分子蛋白、有机物等)降到 最低,保护柱头和柱子。 提取纯化好的样品最好用流动相来溶解,一方面减少色谱图中的溶剂峰干扰,另一方 面也是检查样品在流动相中的溶解性,如果样品进样后在流动相中沉淀,会堵塞进样器和柱 头,甚至样品分解,出现怪峰。如果出现样品与流动相不溶要设法改变溶解条件,如更换样 品溶剂,或改进处理样品的方法,或过滤,去除不溶性物质。 4 检测器的常见故障及对策 液相色谱仪常用的检测器主要有紫外、荧光和电化学检测器。这些检测器的作用就是 收集流经色谱分离柱的各组分在检测器中的信号,根据组分光吸收值/荧光强度/电极表面电 流的变化计算出组分的浓度[4]。
各检测器常见故障主要有: 

4.1 基线噪音较大和对策 对于紫外检测器,氘灯光源打开后要预热 30 分钟以上,基线才能稳定。 氘灯用的过久,接近受命期时(氘灯的寿命约束 1000 小时),会使基线噪音明显增加, 应及时更换氘灯。除光源外,流路中的气泡也会产生噪音。怎样判断基线噪音增大是由于光 源灯的老化还是来自流路中的气泡?可将泵关上,继续走基线,如果噪音立即停止,基线呈 一条直线,说明基线噪音来自流动相中的气泡,应设法排气;若停泵后仍有噪音出现,应考 虑是灯的问题。 电化学检测器中的工作电极(安培型)对气泡十分敏感,仪器的平衡时间较长。流路 中如果有气泡存在,不仅基线会出现尖峰,还会影响检测。因此,做电化学检测时,流动相 的配制要很严格,水要超纯、除还原物,配好后一定要过滤脱气,还应现用现配。如果泵系 统不是 PK 材料,即电化学分析专用仪器,而是普通的高效液相色谱不锈钢泵,应对系统中 的不锈钢材料的输液泵、进样器和管道,在分析前用 6mol/L 硝酸溶液钝化(注意断开分离 柱),可缩短基线平衡时间。还可在流动相中加入 EDTA 离子隐蔽剂,也是可以的。如果有 较大的气泡进到检测器中,光靠泵冲有时太慢,可暂时将泵停止,关上电化学检测器,拆下 工作电极,用超纯水冲洗电极表面,也很奏效的,但对液相色谱技术不太熟练的技术员要小 心操作,不宜反复这样拆卸。

 4.2 检测器污染及对策 管道污染阻塞是检测器常见故障。当流动相用了缓冲盐更换流动相又不当时,常会在 检测器管路中产生沉淀,可先用 5 倍柱积的水冲洗,再用 10 倍柱积的强溶剂(如乙腈)流 过,再用 50 倍的柱体积的异丙醇冲洗,最后换上反相流动相平衡。当检测器管路堵塞时, 可表现为柱压升高,此时,应和柱头堵塞相区分。可断开柱子,直接接检测器,如泵压仍较 高,可判断压力升高是由于检测器管道堵塞造成。检测器进口是常发生阻塞的地方,正向冲 洗效果常不明显,我们的经验是将检测器进出口管道对调,用 6mol/L 硝酸溶液反冲检测器, 能很快将阻塞冲开,但要注意用低流速冲洗,观察压力变化。 检测池阻塞和污染多见紫外检测器。池阻塞也可用上述方法反冲,一般都能疏通。通 常,池阻塞的故障比较少见,而池污染常发生,如不干净的样品在池窗上积聚等,都会造成 检测池污染。表现为基线噪音增大,仪器灵敏度下降。可用注射器依此回抽异丙醇、6mol/L 硝酸,要小心操作,将池中的污物冲洗干净,最后用 100ml 纯水正向冲洗检测池。反向冲 洗还可防止池渗漏。对于电化学检测器,要注意维护工作电极表面的清洁度,当检测器检测 了大量较脏的样品(如血浆、尿液)或用的过久,应用化学法或物理抛光法对电极表面进行 清洁,可提高一定的检测灵敏度,但要注意,最后一定要用纯水冲洗干净,不要带来其它污 染。 我们仅就有限的篇幅谈了一点从事液相色谱分析工作的经验,还有许多问题需要我们大 家共同交流和探讨。高效液相色谱仪是现代科学研究中广泛使用的分析仪器,但我们必须学 会正确的使用和维护,才能更好的驾驭它,让 HPLC 技术在医学领域发挥更大的作用。 

【专题】高效液相色谱仪使用遇到的问题 高效液相色谱仪的几个使用问题 .
色谱柱中的流动相会排干吗? 不少做色谱分离试验的人遇到过这样的情形:不慎未及时补充流动相,泵将溶剂瓶中的流动 相吸干了,HPLC 系统由此而停止工作了。如此情况是否会损坏色谱柱?泵是否已将色谱柱 中所有流动相都排干了?色谱柱还能使用吗?事实上,如果泵将溶剂瓶中的流动相吸干,并 不会造成色谱柱的损坏。即使泵中充满了空气,泵也不会将空气排入色谱柱。因为泵只能输 送液体,而不能输送空气。相比之下,另一个更可能发生的情况是忘记盖上色谱柱两端的密 封盖或盖子太松而使色谱柱变干。同样,整个色谱柱干涸的情况不太容易发生,多半可能只 是色谱柱两端的几个毫米变干了,因挥发掉所有溶剂是色谱柱变干需要相当长的时间。即使 色谱柱真的变干了,也不一定就不可救药了。可以尝试用一种完全脱气的、表面张力低的溶 剂(如经氦气脱气的甲醇)冲洗色谱柱以除去气体。较低的表面张力有助于浸润填料表面; 已脱气的溶剂应该能够溶解并去除滞留在填料中的气体。色谱柱大约需要(以 1mL/min 的 流速)冲一个小时或更多的时间被彻底浸润,恢复到正常状态。

2. 使用 PEEK(polyetheretherketone)管路和接头需要注意什么问题? 如果经常需要改变流路或更换不同品牌的色谱柱,使用 PEEK 材料制成的管路和接头会非常 方便。PEEK 管路容易连接;PEEK 接头不仅无需工具,手拧即可固定,而且容易调节锥箍 之外的管路长度,方便与不同品牌或规格的色谱柱相连接。 bio.jewelove.net 使用此类材料的管路需要注意的是:PEEK 对卤代烷烃和四氢呋喃的兼容性不好。虽然未观 察到上述溶剂溶解 PEEK 材料的明显迹象,但 PEEK 遇到上述溶剂会变脆。另一个西药考虑 的因素是压力限。不锈钢管可耐受 6000psi 的压力,但 PEEK 管只能耐受近 4000psi(但多 数 HPLC 应用系统压力不会超过 3000psi)。 使用 PEEK 接头时则无需担心接头耐溶剂性能,因为接头几乎或很少与溶剂直接接触。但手 拧固定的 PEEK 接头压力限低于不锈钢管,因而压力太高时,可能会使接头在管路上滑动而 产生死体积或漏液。

3. 如何预防液相泵的故障: 要保持泵的良好操作性能,必须维护系统的清洁,保证溶剂和试剂的质量,对流动相进行过滤 和脱气.下面列出预防泵故障的几项措施: 1).用高质量试剂和 HPLC 级溶剂; 2)、过滤流动相和溶剂; 3)、脱气; 4)、每天开始使用时放空排气,工作结束后从泵中洗去缓冲液; 5)、不让水或腐蚀 

色谱柱中的流动相会排干吗? 不少做色谱分离试验的人遇到过这样的情形:不慎未及时补充流动相,泵将溶剂瓶中的流动 相吸干了,HPLC 系统由此而停止工作了。如此情况是否会损坏色谱柱?泵是否已将色谱柱 中所有流动相都排干了?色谱柱还能使用吗?事实上,如果泵将溶剂瓶中的流动相吸干,并 不会造成色谱柱的损坏。即使泵中充满了空气,泵也不会将空气排入色谱柱。因为泵只能输 送液体,而不能输送空气。相比之下,另一个更可能发生的情况是忘记盖上色谱柱两端的密 封盖或盖子太松而使色谱柱变干。同样,整个色谱柱干涸的情况不太容易发生,多半可能只 是色谱柱两端的几个毫米变干了,因挥发掉所有溶剂是色谱柱变干需要相当长的时间。即使 色谱柱真的变干了,也不一定就不可救药了。可以尝试用一种完全脱气的、表面张力低的溶 剂(如经氦气脱气的甲醇)冲洗色谱柱以除去气体。较低的表面张力有助于浸润填料表面; 已脱气的溶剂应该能够溶解并去除滞留在填料中的气体。色谱柱大约需要(以 1mL/min 的 流速)冲一个小时或更多的时间被彻底浸润,恢复到正常状态。

2. 使用 PEEK(polyetheretherketone)管路和接头需要注意什么问题? 如果经常需要改变流路或更换不同品牌的色谱柱,使用 PEEK 材料制成的管路和接头会非常 方便。PEEK 管路容易连接;PEEK 接头不仅无需工具,手拧即可固定,而且容易调节锥箍 之外的管路长度,方便与不同品牌或规格的色谱柱相连接。 bio.jewelove.net 使用此类材料的管路需要注意的是:PEEK 对卤代烷烃和四氢呋喃的兼容性不好。虽然未观 察到上述溶剂溶解 PEEK 材料的明显迹象,但 PEEK 遇到上述溶剂会变脆。另一个西药考虑 的因素是压力限。不锈钢管可耐受 6000psi 的压力,但 PEEK 管只能耐受近 4000psi(但多 数 HPLC 应用系统压力不会超过 3000psi)。 使用 PEEK 接头时则无需担心接头耐溶剂性能,因为接头几乎或很少与溶剂直接接触。但手 拧固定的 PEEK 接头压力限低于不锈钢管,因而压力太高时,可能会使接头在管路上滑动而 产生死体积或漏液。 

3. 如何预防液相泵的故障: 要保持泵的良好操作性能,必须维护系统的清洁,保证溶剂和试剂的质量,对流动相进行过滤 和脱气.
下面列出预防泵故障的几项措施:
 1).用高质量试剂和 HPLC 级溶剂;
 2)、过滤流动相和溶剂;
 3)、脱气;
 4)、每天开始使用时放空排气,工作结束后从泵中洗去缓冲液;
 5)、不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中;
 6)、定期更换垫圈; 
 7)、需要时加润滑油;
 8)、查阅有关泵操作手册中的其它建议。 处于良好操作状态的泵,应该能使色谱图上的基线平稳;保留时间的重复性好。在等度洗脱 时压力波动小于 2%。梯度洗脱时压力变化应是缓慢和平稳的。 为了使故障发生后尽快排除,平时应常备密封、单向阀(入口与出口)、泵头装置、各式接 头、保险丝等部件,以及更换工具。 生物学习之家 性溶剂滞留泵中; 
6)、定期更换垫圈; 
7)、需要时加润滑油;
8)、查阅有关泵操作手册中的其它建议。 处于良好操作状态的泵,应该能使色谱图上的基线平稳;保留时间的重复性好。在等度洗脱 时压力波动小于 2%。梯度洗脱时压力变化应是缓慢和平稳的。 为了使故障发生后尽快排除,平时应常备密封、单向阀(入口与出口)、泵头装置、各式接 头、保险丝等部件,以及更换工具