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液相色谱仪校准方法最新更新

* 来源: 化工仪器网-阔增(上海)生物科技 * 作者: sainaer * 发表时间: 2022-05-25 9:11:50

1. 液相色谱仪的概述

液相色谱仪是由输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统等部分组成的分析仪器。液相色谱仪根据样品中各组分在色谱柱内固定相和流动相间分配或吸附等特性的差异,由流动相将样品带入色谱柱中进行分离,经检测器检测并通过数据处理系统记录色谱图,依据各组分的保留时间和响应值(峰面积或峰高)进行定性和定量分析。


2. 计量性能要求

(1)      输液路接口紧密牢固,在规定的压力范围内无泄漏。

(2)      泵流量设定值误差和流量稳定性应符合下表的要求。

泵流量设定值/(mL/min)

0.2~0.5

0.6~1.0

大于1.0

测量次数

3

3

3

流动相收集时间/min

20~10

10~5

5

泵流量设定值最大允许误差

±5%

±3%

±2%

泵流量稳定性

3%

2%

2%

(3)      梯度最大允许误差:士3%。

(4)      柱温箱温度设定值最大允许误差:±2℃。

柱温箱温度稳定性:不大于1℃/h。

(5)      该仪器的计量性能应符合下表的要求:

检定项目

检测器

紫外-可见光检测器

二极管阵列检测器

荧光检测器

示差折光率检测器

蒸发光散射检测器

基线噪声

≤5×10-4AU

≤5×10-4AU

≤5×10-7RIU

≤1mV

基线漂移

≤5×10-3AU/30min

≤5×10-3FU/30min

≤5×10-6RIU/30min

≤5mV/30min

最小检测浓度

≤5×10-8g/mL

萘-甲醇溶液

≤5×10-9g/mL

萘-甲醇溶液

≤5×10-6g/mL

甲醇溶液

≤5×10-6g/mL

甲醇溶液

波长示值最大允许误差

±2nm

±5nm

——

——

波长重复性

≤2nm

≤2nm

——

——

线性范围

优于103

优于103

优于103

——

定性重复性

≤1.0%

≤1.0%

≤1.0%

≤1.5%

定量重复性

≤3.0%

≤3.0%

≤3.0%

≤4.0%

3.计量器具校准

(1)环境条件

室温为(15~30)℃,校准过程中温度变化不超过3℃(对示差折光率检测器,室温变化不超过2℃),室内相对湿度:(20~85)%;室内不得存放易燃、易爆和强腐蚀性的物质,无机械振动和电磁干扰,通风良好。

(2)校准使用标准物质

a.  萘-甲醇溶液标准物质:认定值为1.00×10-4g/mL,扩展不确定度小于4%, K=2;

b.  萘-甲醇溶液标准物质:认定值为1.00×10-7g/mL,扩展不确定度小于4%, K=2;

c.  甲醇中胆固醇溶液标准物质:认定值为200μg/mL,扩展不确定度小于2.0%, K=2;

d.  甲醇中胆固醇溶液标准物质:认定值为5.0μg/mL,扩展不确定度小于5.0%, K=2;

e.  胆固醇纯度标准物质:认定值为99.7%,扩展不确定度小于0.1%, K=2。


(3) 液相色谱仪校准项目

1) 外观检测

2) 输液系统

a.  泵耐压

b.  泵流量设定值误差

c.  泵流量稳定性

d.  梯度误差

3) 柱温箱

a.  温度设定值误差

b.  温度温度性

4) 检测器

a.  基线噪声

b.  基线漂移

c.  最小检测浓度

d.  波长示值误差和重复性

e.  线性范围

5) 整机:定性、定量重复性

(4)外观检查

用目测、手动法进行检查。

(5)输液系统

a.  泵耐压:将仪器各部分连接好,以*甲醇(或纯水)为流动相,流量为0.2 mL/ min,按说明书启动仪器,压力平稳后保持10 min,用滤纸检查各管路接口处是否有湿迹。卸下色谱柱,堵住泵出口端(压力传感器以下),使压力达到最大允许值的90%,保持5 min应无泄漏。

b.  泵流量设定值误差和流量稳定性:按要求设定好流量,启动仪器,压力稳定后,在流动相出口处用事先称重过的洁净容量瓶收集流动相,同时用秒表计时,收集规定时间内流出的流动相,在分析天平上称重,计算流量实测值,重复测量3次。

c.  梯度误差:由梯度控制装置设置阶梯式的梯度洗脱程序,A溶剂为纯水,B溶剂为含0. 1%丙酮的水溶液。将输液和检测器连接(不接色谱柱),开机后以A溶剂冲洗系统,基线平稳后开始执行梯度程序,画出B溶剂经由5段阶梯从0%变到*的梯度变化曲线。求出由B溶剂变化所产生的每一段阶梯对应的响应信号值的变化值,重复测量2次,计算结果。

(6)柱箱温度设定值误差和稳定性校准

a.  将数字温度计探头固定在柱温箱内与色谱柱相同的部位,选择35℃和45℃ (也可根据使用温度设定)进行校准;

b.  按仪器说明书操作,通电升温,待温度稳定后,记下温度计读数并开始计时,以后每隔10 min记录1次读数,共计7次,求出平均值。

c.  平均值与设定值之差为柱温箱温度设定值误差,7次读数中最大值与最小值之差为柱温箱温度稳定性。

(7)检测器校准(以紫外-可见光检测器和二极管阵列检测器为例)

a.  波长示值误差和重复性

将检测器和数据处理系统连接好,通电预热稳定后,用注射器将纯水注入检测池内进行冲洗后,充满检测池。待检测器示值稳定后,在(235土5) nm、(257士5) nm、(313士5) nm和(350士5) nm的波长下将示值回零,然后再用注射器将紫外分光光度计溶液标准物质(参考波长为235 nm,257 nm,313 nm和350 nm)从检测器入口注入样品池中冲洗,并将样品池充满至示值稳定。将检测器波长调到低于参考波长5nm处(例如检定257 nm时,检测器波长先调到252 nm),改变检测器波长,每(5 ~10) s改变1 nm,记录每个波长下的吸收值,最大或最小吸收值对应的波长与参考波长之差为波长示值误差。每个波长重复测量3次,其中最大值与最小值之差为波长重复性。

b.  基线噪声和基线漂移

选用C18色谱柱,以*甲醇为流动相,流量为1.0 mL/min,紫外检测器的波长设定为 254 nm,检测灵敏度调挡。开机预热,待仅器稳定后记录基线 30min,选取基线中噪声最大峰-峰高对应的信号值,计算基线噪声。

c.  最小检测浓度

在基线噪声和基线漂移的色谱条件下,由进样系统注入(10~ 20) μL的1.00×10-7g/mL萘-甲醇溶液,记录色谱图,由色谱峰高和基线噪声峰高,计算最小检测浓度。

d.  线性范围

将检测器和数据处理系统连接好,检测器波长设定为254 nm,通电稳定后,用注射器直接向检测池中注射2%异丙醇-水溶液冲洗检测池至示值稳定后,记下此值。然后,依照上法向检测池中依次分别注入丙酮-2%异丙醇系列水溶液(丙酮含量为0.1%,0.2%,…,1.0%),并记下各溶液对应的稳定响应信号值,每个溶液重复测量3次,取算术平均值。以5个丙酮溶液浓度(0.1%,0.2%,0.3%, 0.4%,0.5%)和对应的响应信号值做标准曲线,在曲线上找出丙酮溶液浓度大于0. 5%各点的读数,与相应各浓度点的测量值做比较,量值相差5%时的依度作为检测上限。按得到的最小检测浓度为检测下限,他们的比值即为线性范围。

(8)定性和定量重复性校准

将仪器各部分联接好,选用C18色谱柱,用*甲醇为流动相,流量为1.0mL/min,根据仪器配置的检测器,选择相应的测量参数如紫外可见光检测器和二极管阵列检测器波长设定为254 nm,灵敏度选择适中,基线稳定后由进样系统注入一定体积的1.0×10-4 g/mL萘-甲醇溶液标准物质,其他检测器选择相应的参数。连续测量6次,记录色谱峰的保留时间和峰面积,最后计算相对标准偏差。