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液相色谱仪系统介绍用途

* 来源: 无锡赛那尔 * 作者: admin * 发表时间: 2020-06-19 19:23:14
液相色谱仪系统介绍用途-高效液相色谱仪工作原理

高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统,下面将分别叙述其各自的组成与特点。 
1.进样系统 
  一般采用隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操作,进样量是恒定的。这对提高分析样品的重复性是有益的。 
2.输液系统 
  该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。高压泵的一般压强为l.47~4.4X107Pa,流速可调且稳定,当高压流动相通过层析柱时,可降低样品在柱中的扩散效应,可加快其在柱中的移动速度,这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。流动相贮存错和梯度仪,可使流动相随固定相和样品的性质而改变,包括改变洗脱液的极性、离子强度、PH值,或改用竞争性抑制剂或变性剂等。这就可使各种物质(即使仅有一个基团的差别或是同分异构体)都能获得有效分离。 
3.分离系统 
  该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱一般长度为10~50cm(需要两根连用时,可在二者之间加一连接管),内径为2~5mm,由"优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成,住内装有直径为5~10μm粒度的固定相(由基质和固定液构成).固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成,它们都有惰性(如硅胶表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性(孔径可达1000?)和比表面积大的特点,加之其表面经过机械涂渍(与气相色谱中固定相的制备一样),或者用化学法偶联各种基因(如磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等)或配体的有机化合物。因此,这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。例如,在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素(PSA)后,就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来。 
另外,固定相基质粒小,柱床极易达到均匀、致密状态,极易降低涡流扩散效应。基质粒度小,微孔浅,样品在微孔区内传质短。这些对缩小谱带宽度、提高分辨率是有益的。根据柱效理论分析,基质粒度小,塔板理论数N就越大。这也进一步证明基质粒度小,会提高分辨率的道理。 
再者,高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60C,通过改善传质速度,缩短分析时间,就可增加层析柱的效率。 
4.检测系统 
  高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器三种。 
(1)紫外检测器 
  该检测器适用于对紫外光(或可见光)有吸收性能样品的检测。其特点:使用面广(如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用);灵敏度高(检测下限为10-10g/ml);线性范围宽;对温度和流速变化不敏感;可检测梯度溶液洗脱的样品。 
(2)示差折光检测器 
  凡具有与流动相折光率不同的样品组分,均可使用示差折光检测器检测。目前,糖类化合物的检测大多使用此检测系统。这一系统通用性强、操作简单,但灵敏度低(检测下限为10-7g/ml),流动相的变化会引起折光率的变化,因此,它既不适用于痕量分析,也不适用于梯度洗脱样品的检测。 
(3)荧光检测器 
  凡具有荧光的物质,在一定条件下,其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比。因此,这一检测器只适用于具有荧光的有机化合物(如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等)的测定,其灵敏度很高(检测下限为10-12~10-14g/ml),痕量分析和梯度洗脱作品的检测均可采用。 
5.数据处理系统 
  该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作,使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。


电泳基础知识及电泳分析常用方法
     电泳是指荷电的胶体颗粒在电场中的移动。
     在离子移动的物理化学理论中,按照Debye-Huckel的理论。电泳决定于环绕每个离子的离子雾中的扩散双电层。当离子的尺寸越大、溶液的离子强度越高时,这种电泳现象就变得越明显。所以电泳现象中的表面电势和双电层的因素起着决定性的作用。
早期研究发现,许多生物胶体,如蛋白质、酶等有特征的电泳迁移率。此迁移率在很大程度上取决于溶液的pH。因此利用这种电泳特征作为对物质的鉴定引起人们广泛的兴趣。特别在那个时候,关于蛋白质和酶的化学本质和物理性质还知道得不多。
    以后,电泳不仅作为一种现象,而且作为一种技术方法得到不断发展。从界面分离到各种区带电泳,开辟了混合物的电泳分析的可能性。由于电泳性质的高度特异性,甚至用结晶纯化的样品也可在电泳分析中分出两个或更多的电泳带。又由于电泳方法的温和性,对不稳定的生物大分子的分离纯化有时比其他分离技术如沉淀、离心、层析等更为方便、可靠,甚至可作为具有一定规模的制备方法。
分析方法:
一)醋酸纤维素薄膜电泳 
     醋酸纤维素是提纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯。由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。这种薄膜对蛋白质样品吸附性小,几乎能完全消除纸电泳中出现的“拖尾”现象,又因为膜的亲水性比较小,它所容纳的缓冲液也少,电泳时电流的大部分由样品传导,所以分离速度快,电泳时间短,样品用量少,5靏的蛋白质可得到满意的分离效果。因此特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。 
醋酸纤维素膜经过冰醋酸乙醇溶液或其它透明液处理后可使膜透明化有利于对电泳图谱的光吸收扫描测定和膜的长期保存。 
⒈材料与试剂醋酸纤维素膜一般使用市售商品,常用的电泳缓冲液为pH8.6的巴比妥缓冲液,浓度在0.05-0.09mol/L。 
⒉操作要点 
⑴膜的预处理:必须于电泳前将膜片浸泡于缓冲液,浸透后,取出膜片并用滤纸吸去多余的缓冲液,不可吸得过干。 
⑵加样:样品用量依样品浓度、本身性质、染色方法及检测方法等因素决定。对血清蛋白质的常规电泳分析,每cm加样线不超过1靗,相当于60-80靏的蛋白质。 
⑶电泳:可在室温下进行。电压为25V/cm,电流为0.4-0.6mA/cm宽。 
⑷染色:一般蛋白质染色常使用氨基黑和丽春红,糖蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸-Schiff试剂,脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色。 
⑸脱色与透明:对水溶性染料最普遍应用的脱色剂是5%醋酸水溶液。为了长期保存或进行光吸收扫描测定,可浸入冰醋酸:无水乙醇=30:70(V/V)的透明液中。 
 
(二)凝胶电泳 
     以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳。其中聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。琼脂糖凝胶孔径较大,对一般蛋白质不起分子筛作用,但适用于分离同工酶及其亚型,大分子核酸等应用较广,介绍如下: 
⒈琼脂糖凝胶电泳的原理概述琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元是D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束,构成大网孔型凝胶。因此该凝胶适合于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、鉴定及纯化。在临床生化检验中常用于LDH、CK等同工酶的检测。 
⒉琼脂糖凝胶电泳分离核酸的基本技术在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中,DNA分子的电泳迁移率与其分子量的常用对数成反比;分子构型也对迁移率有影响,如共价闭环DNA>直线DNA>开环双链DNA。当凝胶浓度太高时,凝胶孔径变小,环状DNA(球形)不能进入胶中,相对迁移率为0,而同等大小的直线DNA(刚性棒状)可以按长轴方向前移,相对迁移率大于0。 
⑴设备与试剂:琼脂糖凝胶电泳分为垂直及水平型两种。其中水平型可制备低浓度琼脂糖凝胶,而且制胶与加样都比较方便,故应用比较广泛。核酸分离一般用连续缓冲体系,常用的有TBE(0.08mol/l Tris·HCl,pH8.5,0.08mol/L硼酸,0.0024mol/l EDTA)和THE(0.04mol/l Tris·HCl。pH7.8,0.2mol/L醋酸钠,0.0018mol/l EDTA)。 
⑵凝胶制备:用上述缓冲液配制0.5%-0.8%琼脂糖凝胶溶液,沸水浴或微波炉加热使之融化,冷至55℃时加入溴化乙锭(EB)至终浓度为0.5靏/ml,然后将其注入玻璃板或有机玻璃板组装好的模子中,厚度依样品浓度而定。注胶时,梳齿下端距玻璃板0.5-1.0mm,待脱凝固后,取出梳子,加入适量电极缓冲液使板胶浸没在缓冲液下1mm处。 
⑶样品制备与加样:溶解于TBE或THE内的样品应含指示染料(0.025%溴酚蓝或桔黄橙)、蔗糖(10%-15%)或甘油(5%-10%),也可使用2.5%Fico Ⅱ增加比重,使样品集中,每齿孔可加样5-10靏。 
⑷电泳:一般电压为5-15V/cm。对大分子的分离可用电压5V/cm。电泳过程最好在低温条件下进行。 
⑸样品回收:电泳结束后在紫外灯下观察样品的分离情况,对需要的DNA分子或特殊片段可从电泳后的凝胶中以不同的方法进行回收,如电泳洗脱法:在紫外灯下切取含核酸区带的凝胶,将其装入透析袋(内含适量新鲜电泳缓冲液),扎紧透析袋后,平放在水平型电泳槽两电极之间的浅层缓冲液中,100V电泳2-3小时,然后正负电极交换,反向电泳2分钟,使透析袋上的DNA释放出来。吸出含DNA的溶液,进行酚抽提、乙醇沉淀等步骤即可完成样品的回收。其它还有低融点琼脂糖法、醋酸铵溶液浸出法、冷冻挤压法等,但各种方法都仅仅有利于小分子量DN****段(<1kb)的回收,随着DNA分子量的增大,回收量显著下降。 
 
(三)等电聚焦电泳技术 
      等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)是60年代中期问世的一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可达0.01pH单位,因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。 
⒈IEF的基本原理在IEF的电泳中,具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极,pH值逐渐增大。如前所述,蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征,这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动,直至某一pH位点时失去电荷而停止移动,此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点(pl)。同理,位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动,直到它们的等电点上聚焦为止。可见在该方法中,等电点是蛋白质组分的特性量度,将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中,在电场内经过一定时间后,各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上,形成分离的蛋白质区带。
⒉pH梯度的组成pH梯度的组成方式有二种,一种是人工pH梯度,由于其不稳定,重复性差,现已不再使用。另一种是天然pH梯度。天然pH梯度的建立是在水平板或电泳管正负极间引入等电点彼此接近的一系列两性电解质的混合物,在正极端吸入酸液,如硫酸、磷酸或醋酸等,在负极端引入碱液,如氢氧化钠、氨水等。电泳开始前两性电解质的混合物pH为一均值,即各段介质中的pH相等,用pH0表示。电泳开始后,混合物中pH最低的分子,带负电荷最多,pI1为其等电点,向正极移动速度最快,当移动到正极附近的酸液界面时,pH突然下降,甚至接近或稍低于PI1,这一分子不再向前移动而停留在此区域内。由于两性电解质具有一定的缓冲能力,使其周围一定的区域内介质的pH保持在它的等电点范围。pH稍高的第二种两性电解质,其等电点为pI2,也移向正极,由于pI2>pI1,因此定位于第一种两性电解质之后,这样,经过一定时间后,具有不同等电点的两性电解质按各自的等电点依次排列,形成了从正极到负极等电点递增,由低到高的线性pH梯度。 
⒊两性电解质载体与支持介质理想的两性电解质载体应在pI处有足够的缓冲能力及电导,前者保证pH梯度的稳定,后者允许一定的电流通过。不同pI的两性电解质应有相似的电导系数从而使整个体系的电导均匀。两性电解质的分子量要小,易于应用分子筛或透析方法将其与被分离的高分子物质分开,而且不应与被分离物质发生反应或使之变性。 
常用的pH梯度支持介质有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等,其中聚丙烯酰胺凝胶为最常应用。 
电泳后,不可用染色剂直接染色,因为常用的蛋白质染色剂也能和两性电解质结合,因此应先将凝胶浸泡在5%的三氯醋酸中去除两性电解质,然后再以适当的方法染色。 
 
(四)其他电泳技术 
⒈IEF/SDS-PAGE双向电泳法1975年O′Farrall等人根据不同组份之间的等电点差异和分子量差异建立了IEF/Sd S-PAGE双向电泳。其中IEF电泳(管柱状)为第一向,SDS-PAGE为第二向(平板)。在进行第一向IEF电泳时,电泳体系中应加入高浓度尿素、适量非离子型去污剂NP-40。蛋白质样品中除含有这两种物质外还应有二硫苏糖醇以促使蛋白质变性和肽链舒展。 
IEF电泳结束后,将圆柱形凝胶在SDS-PAGE所应用的样品处理液(内含SDS、-巯基乙醇)中振荡平衡,然后包埋在SDS-PAGE的凝胶板上端,即可进行第二向电泳。 
IEF/ SDS-PAGE双向电泳对蛋白质(包括核糖体蛋白、组蛋白等)的分离是极为精细的,因此特别适合于分离细菌或细胞中复杂的蛋白质组分。 
⒉毛细管电泳 Neuhoff等人于1973年建立了毛细管均一浓度和梯度浓度凝胶用来分析微量蛋白质的方法,即微柱胶电泳,均一浓度的凝胶是将毛细管浸入凝胶混合液中,使凝胶充满总体积的2/3左右,然后将其揿入约厚2mm的代用粘土垫上,封闭管底,用一支直径比盛凝胶的毛细管更细的硬质玻璃毛细管吸水铺在凝胶上。聚合后,除去水层并用毛细管加蛋白质溶液(0.1-1.0靗,浓度为1-3mg/ml)于凝胶上,毛细管的空隙用电极缓冲液注满,切除插入粘土部分,即可电泳。 


基因枪法的定义|原理|应用
    一.基因枪法的定义与原理
基因枪法是一种全新的基因导入仪技术,它把遗传物质或其他物质附着于高速微弹直接射入细胞、组织和细胞器,是目前国际上最先进的基因导入技术。气体基因枪以压缩气体(氦或氮)转换成的气体冲击波为动力,使气体基因枪枪产生一种“冷”的气体冲击波进入轰击室,因此可免遭由“热”气体冲击波引起的细胞损伤。气体基因枪可在广泛的细胞型中得到瞬时的、稳定的和高效率的转化作用。气体基因枪有一个产生冲击波的特殊结构,在恰当的气压范围内从3.5MPa-10MPa,具有相应不同的可破裂膜,将包覆DNA的粒子穿越,射入在轰击室底部的靶细胞中(最大靶直径50mm)。基因枪适用于动植物、细胞培养物、胚胎、细菌及小型动物的转基因。具有快速、简便、安全、高效的特点。
基因枪法是一种全新的基因导入仪技术,它把遗传物质或其他物质附着于高速微弹直接射入细胞、组织和细胞器,是目前国际上最先进的基因导入技术。气体基因枪以压缩气体(氦或氮)转换成的气体冲击波为动力,使气体基因枪枪产生一种“冷”的气体冲击波进入轰击室,因此可免遭由“热”气体冲击波引起的细胞损伤。气体基因枪可在广泛的细胞型中得到瞬时的、稳定的和高效率的转化作用。气体基因枪有一个产生冲击波的特殊结构,在恰当的气压范围内从3.5MPa-10MPa,具有相应不同的可破裂膜,将包覆DNA的粒子穿越,射入在轰击室底部的靶细胞中(最大靶直径50mm)。基因枪适用于动植物、细胞培养物、胚胎、细菌及小型动物的转基因。 
    二.基因枪法的应用
1.基因转殖于目标细胞, 组织, 器官或活体          2.基因功能短暂表现之研究 
3.功能稳定性表现之研究                                  4.遗传或癌症相关之研究 
5.DNA疫苗的研究与应用                                 6.基因治疗相关之研究 
7.基因转殖植物之研究                                     8.基因工程或药物相关研究


农产品质检站实验室的相关仪器配置
农产品质检站是检测农产品质量的机构,对于农产品检测的项目包括水份,糖量,含氮量,颜色,酸碱度,农药残留等方面。要组建一个完备的农产品质检站实验室需要哪些仪器呢?上海天呈医流为您的实验室组建提供如下参考:
(1)酸度计:酸度计即PH计,是测量pH值的仪器。在农产品检测实验室,配置相关的检测试剂以及测量未知溶液的酸碱度都会用到酸度计。
(2)电导率仪:利用电导率仪可以测量电解质溶液的电导率值。 
(3)色谱仪:分为液相色谱仪和气相色谱仪,用于对农产品中物质含量进行定性和定量分析。 
(4)自动电位滴定仪:通过测量电极电位变化,来测量离子浓度。可以用于酸碱滴定、氧化还原滴定、沉淀滴定、络合滴定等。 
(5)光度计:光度计分为几种,其中可见分光光度计,紫外—可见分光光度计可以用于测量物质对不同波长单色辐射的吸收程度,定量分析;荧光分光光度计用于易形成氢化物元素、易形成气态组分元素和易还原成原子蒸汽元素的测定;原子吸收分光光度计是根据被测元素的基态原子对特征辐射的吸收程度进行定量分析;红外分光光度计是根据物质在红外光区的吸收光谱特征和朗伯比尔定律对物质进行定性定量分析;原子荧光光度计和双道原子荧光光度计也是用于定性、定量分析。
(6)水份仪:在农产品检测过程中,经常需要测定农产品的含水量,水分仪就是用于测定含水量的仪器。微量水份测定仪用于检测农产品中的微量水份。
(7)光谱仪:光谱仪有多种,红外光谱仪用于物质的定性和定量分析 。 
(8)色差计:在比较农产品的颜色时,单凭肉眼观察有时不易比较,色差计就是测量颜色的仪器。
(9)旋光仪:用于测量物质的旋光度,分析物质的浓度,纯度,含糖量。 
(10)酶标仪:根据抗原抗体免疫反应的原理,可以进行酶联免疫吸附测定,利用酶标仪测定吸光度,进而对物质进行定性和定量得分析。 
(11)微量移液器:在移取微量溶液时,使用微量移液器可以准确量取溶液体积。 
(12)气质联用仪:对农产品中物质进行定性和定量的分析。
(13)阿贝折射仪:测量物质的折射率 
(14)白度计:用于测量面粉.淀粉等粉剂的白度值。
(15)氨基酸自动分析仪:农产品的检测中经常会涉及到检测氨基酸含量,氨基酸自动分析仪为检测氨基酸含量提供方便。
(16)************测定仪:************对于食用者危害较大,************测定仪可以测定************含量。
(17)甲醛氨测定仪:可以测定甲醛和氨的含量。
(18)降落值测定仪:测定谷物面粉及其它含有淀粉的产品中淀粉酶活性 
(19)浊度仪:测定浑浊度的一种仪器。 
(20)自动检糖计:可以测量农产品的含糖量,糖度。 
(21)农药残留测定仪:农产品中农药残留检测是比较重要的检测项目,利用农药残留测定仪可以定性测定农药残留成份。
(22)面筋测定仪:可以测定小麦粉中面筋含量 。
(23)食品二氧化硫测定仪:测量二氧化硫浓度(库仑滴定法)。 
(24)纤维测定仪:测定农产品中纤维含量。 
(25)脂肪测定仪:测定农产品中的脂肪含量。
总之,以上列出的是农产品质检站实验室的常规仪器配置,在实际组建过程中,用户可以根据自身的检测需求,选择合适自己需要的仪器。如果您需要订购相关仪器,请致电上海天呈医流,我们将为您的实验室组建提供便利!