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高效液相色谱技术在食品分析中的作用

* 来源: 无锡赛那尔 * 作者: sainaer * 发表时间: 2018-07-09 9:35:38

高效液相色谱技术在食品分析中的作用概述: 

   食品安全问题是消费者一直以来关注的焦点问题,近些年来由于食品安全造成的人员与财产的损失屡见不鲜。对于食品的检验是一项极为重要的过程,随着科学技术的发展,越来越多的方法已经被运用到检验上来,而高效液相色谱法是其中很具有代表性的一种方法。随着消费者物质生活水平的提高,对于生活质量的要求也越来越高,民以食为天,食品安全问题成为了消费者与社会关注的焦点问题。在相关的食品的检验与检测的过程中,高效液相色谱法是当前运用的较为普遍的一种方法,有许许多多的优点。

 
  高效液相色谱法的具体概念
 
  根据这种方法的名称,在具体的操作过程中我们可以把这种方法分为两部分。其工作原理是食品中对于不同物质来说在不同的环境下,像移动速度或者分离程度的不同,来检测食品中是否有一种化学元素与物质的存在或者存在的数量是多少。这种方法比较于其他方法的优点是操作十分的简单,所得到的结果也能直接的表现出来不需要拐弯抹角,并且具有很高的灵活性。这种方法已经不仅仅应用在上述的领域,在其他的领域也取得了很大的进展和突破,所带来的效益是十分的广泛的,因此必须重视这种方法带来的优点进行具体的分析。
 
  高效液相色谱法在具体的食品检验的应用
 
  高效液相色谱法在食品安全检测的领域主要用来检测添加剂及其种类的相关检测。添加剂问题一直是与食品问题的核心问题。由于添加剂的种类繁多导致了对于它的检测有时候并不能做到完全的检验完成。而运用色谱法我们可以很好的检验出添加剂的种类以及每种物质所含的含量,比起其他地办法更加准确。在检测的过程中必须严格遵守国家相关法律法规以及标准,对于出现问题的食品进行及时的发现与处理。无论是对于天然物质还是人工合成物质这种方法都具有很好的准确性。
 
  食品具体分析的过程不仅仅有关于食品中添加剂的检测,还有其他方面的检测。例如食物中有可能存在的相关药物的残留以及其他相关物质的影响。这些药物的残留很多是发生在蔬菜瓜果等生鲜物上,而这种方法在此类型的食品检验方面也是优点很多的,运用相关的仪器以及方法对于残留物比如甲胺以及其相关的残留物进行分析,确定农药的残留,让残留多的食物及时下架,保证人民的安全。
 
  在其他检测方面这种方法也是极具优势,并且不断地进行发展。随着人民生活水平的提高以及科学技术的改革创新,有些需要检测的物质已经超出了人们的认知,这也需要这种检验的方法不断的进行创新,以迎合时代的发展。这就出现了一种联合检测的方法,结合物理与化学的多个领域进行具体的分析,让最终检测的结果有一个全面性,让检测结果更加全面以及有说服力。这一过程中HPLC与其他的技术相连结,充分发挥多种因素的共同作用,带入相关的洗脱与扫描的技术,对于添加剂与残留物的数值有一个具体的分析,最终得到精确的报告,以此来保证食物的安全,保障人民的生命安全。
 
  随着消费者物质生活的不断提高,对于其他各方面的需求也会不断的提升,现阶段我们要求的是更高的生活质量,为了提高生活质量就对于相关的食品安全及时监控,这就要求我们需要不断地更新技术,本文中提到的高效液相色谱法就是其中之一,需要结合实际情况不断的进行技术上的革新,只有这样才能更好地进行食品安全的监控,及时发现问题,严厉打击不法商家,还百姓一个安全的食用环境,让百姓能够安居乐业。


1.前言

    当代分析仪器发展的方向是高速,高灵敏度,高精确度,自动化和省力。在色谱法领域中,二十世纪60年代后半期,气相色谱法理论的应用使柱色谱法得到了显著发展,而柱色谱中开发的技术和方法又被薄层色谱法和液相色谱法所采有,从而使色谱法的功能大大提高,应用领域日益扩大。为了把这些现代色谱法和过去的方法相区别,把它们称为高效色谱法。高效色谱法的建立,使色谱法在分析化学中的地位得到了提高。如今,色谱法在分析组成复杂的物质和多组分混合物时,是极为重要的分析方法。应用色谱法的目的是进行定量分析和单个分离出纯物质。实际上,可根据分析目的,采用气相色谱法、液相色谱法和薄层谱法中的一种或相互联用之。液相色谱法和薄层色谱法中,所有可溶于流动相的物质均可作为分析对象。由于液相色谱在高效、简便、快速方面倍受分析工作者推崇。使用较为广泛,而薄层色谱则因分析时间较长,定量精确度觉差而作为高效液相色普预实验方法。

    高效液相色谱法(HPLC)是20世纪60年代发展起来的一种新型分析、分离技术。它是在经典液相色谱法的基础上,引入气相色谱法的理论和技术,以高压输送流动相,采用高效固定相及高灵敏度检测器发展而成的现代液相色谱分析方法。现代HPLC采用了*********柱(约1~3mm)和极细小的高效色谱填料(粒径<5μm),用高压输液泵使溶剂以高流速(1~10cm/s)通过色谱柱,分离速度比经典柱色谱法快100~1000倍,分离效率已接近毛细管柱气相色谱法。因此, HPLC具有高压、高速、高效、高灵敏度四大特点。HPLC与GC比较,虽然需要解决延长使用寿命的问题,但专家们普遍认为在众多分析领域中HPLC比GC 更加实用。HPLC能够分析受到热稳定性和挥发性限制的化合物,而用GC分析这些化合物时则必须借助其衍生物。由于HPLC具有高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可反复利用、流出组分易收集等优点,所以被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等领域。

2HPLC在糖类分析中的应用

    糖是由碳、氢、氧3种元素组成的有机化合物,亦称碳水化合物,根据其分子结构分为单糖、双糖、低聚糖和多糖。食品分析工作者对糖分析方法的要求是既要适用于简单食品,又要适用于复杂加工的食品,而且测定要准确、迅速、可靠。HPLC法测定糖具有明显的优势,并得到了广泛的应用。糖的HPLC测定法主要有两类。一类采用阳离子交换剂或者凝胶柱,以水、醋酸钙溶液或稀酸等作为流动相。第二类是使用化学键合固定相,流动相为乙腈-水。

2.1 低分子糖的分析

    低分子糖的分析,是指单糖到四糖的分析,食品分析专家要求能准确地测定部分或全部果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖。果糖、葡萄糖、蔗糖的分析可以提供蔗糖转化的程度及转化糖在产品中的含量;乳糖常作为脱脂奶粉等乳制品的一个主要指标;蔗糖则是zui常见的食品成分,这些都是HPLC分析食品中低分子糖的典型例子。用氨基键合相硅胶柱进行低分子糖的分析时,其典型的色谱条件是:柱长15~25cm,流动相为乙腈溶液(乙腈20~80%),检测用示差折光检测器(RID),进样量通常为10~100μL,分析时间一般在20min以内[3]

2.2 低聚糖的分析

     低聚糖的分析与上述低分子糖的分析极为相似,同样可用氨基健合柱,但是流动相中水的比例要增加到40~60%,分析时间较长,大约需要30min。近来国内已有不少文献报导。陈洪用HPLC法测定了饴糖中的低聚糖,发现饴糖中的低聚糖以麦芽糖为主,含量为25~39%,另外还含少量的葡萄糖、麦芽三糖和麦芽四糖,葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖的zui低检出限在微克级。还有文献报导了用高效液相色谱法分析蔗果低聚糖合成液和测定异麦芽低聚糖的组分。

2.3 多糖分析

    多糖的分析,主要是用于分离纯化及纯度和分子量的测定。过去常用的测定方法有超速离心法、高压电泳法、渗透压法、粘度法和光散射法等。使用这些方法,操作麻烦,结果误差很大。七十年代以后,由于耐高压合成凝胶的出现,HPLC已可用于多糖纯度和分子量的测定以及制备多糖的分离,这样效果更好。

3HPLC在氨基酸分析中的应用

    测定氨基酸的标准方法是利用与茚三酮的显色反应和离子交换色谱法分离。但是,Baky-er,E.于1976年用HPLC法分析氨基酸是利用衍生反应,使之转化成具有强荧光衍生物检测的浓度要比茚三酮反应低4-5个数量级。所以该法要比气相色谱法要灵敏。HPLC法的操作条件是采用双柱系统,柱1用梯度洗脱,柱2用恒定洗脱。荧光检测DNS-氨基酸的激发波长为340nm,发射波长为510nm。可用正相色谱分离,在1毫升/分钟流速下,柱温65℃时可得到18种氨基酸的分离图谱。也可用反相色谱分离,在1.5毫升/分钟流速下,柱温45℃可得到17种氨基酸的分离图谱。检测灵敏度和操作时间比标准方法都有很大提高。

    在该方法研究的基础上,有人先后把它用于分析粮食中的赖氨酸、蛋氨酸和色氨酸。J.J.Warthesen和P.L.Lramer1987年报道用HPLC法测定强化小麦粉中游离的赖氨酸。他们先从强化的面粉或面包中提取游离赖氨酸,用三氯醋酸沉淀蛋白质,离心后取上清液用0.1M硼酸缓冲液调PH至9.0,zui后定容到一定量。接着进行丹酰反应,让赖氨酸提取液与氯化丹酰******液于40℃避光条件下反应生成二丹酰赖氨酸衍生物。二丹酰赖氨酸衍生物通过十八烷基键合相柱,以乙腈/0.01MNa2HPO4(2:5)为流动相,在1.5毫升/分钟流速下于8分钟后分离出来,用紫外检测器254nm外测。W.R.Peterson等人以大豆、酪蛋白、面筋、玉米为例,提出用HPLC法测定食品蛋白质中总赖氨酸和有效赖氨酸的分析方法。关于赖氨酸的测定方法与前者基本相同,只是增加一个用6.0NHCL水解的步骤,并把1.0毫克分子氯化丹酰******液浓度提高到150毫克分子。在有效赖氨酸(具有游离ε-氨基的赖氨酸,若ε-氨基发生变化,会使赖氨酸失去营养强性)的测定中,又用HPLC法与氟代二硝基苯分光光度法进行了比较,其分析结果没明显差异。而且HPLC还比后者少了一个样品净化过程。色谱分离ε-二硝基苯赖氨基仍用十八烷基键同相柱,乙腈/0.01M醋酸缓冲液(20:80)(PH4.0)为流动相,于紫外可见光检测器436nm处测定 。

    分析强化食品中游离蛋氨酸的HPLC法是Okeefe.L.L.和Warthesen.J.J.提出的,用1.0%甲醇从强化食品中提取DL-蛋氨酸,再用三氯醋酸沉淀蛋白质,经过滤用5NNAOH把滤液PH调至9.5,用水定容后取部分提取液进行丹酰反应。蛋氨酸的丹酰衍生物与其氯化物通过十八烷基键合相柱,乙腈/0.01MNa2HPO4(1:4,PH7.9)作流动相,在2毫升/分钟流速下得到分离,于紫外检测器254mn处测定。

    用HPLC法测定食品中的色氨酸是利用分子本身的荧光,直接通过荧光计检测,激发波长为283nm,发射波为343nm。用多孔硅胶柱分离,PH3.8的醋酸缓冲液作流动相,在2.5毫升/分钟流速下获得大麦水解物的色氨酸分离图谱。检测范围是8×10-9―270×10-9克。在这项研究中,用含有麦芽糊精的6MNAOH水解蛋白质。麦芽糊精作抗氧剂,可提高某些酶(溶菌酶,胰凝乳朊酶)中色氨酸的回收,但对菜籽粉中色氨酸的回收没影响。同时还证明蛋白质水解时间对色氨酸回收的影响。

4.HPLC在脂肪酸分析中的应用

     谷物与饲料中的脂肪酸提取物可以它们的P-溴代苯酰甲酯衍生物形式用HPLC法分离测定。在溶于A/甲醇(2:1)液的类脂提取物中加入0.05N的氢氧化钾/甲醇溶液,使碱与酸的克分子比例至少在9:1,再通过旋转蒸发器浓缩样品。皂化产物不必离析出来,类脂提取物在催化剂和苯酰甲基溴化物作用下,70-80℃、30分钟之内可完成衍生反应。脂肪酸的P-溴代苯酰甲酯衍生物在十八烷基键合相柱上分离,甲醇/水(90:10)为流动相,以1毫升/分钟流速,室温条件下用紫外检测器分析。该法说明利用衍生反应分析谷物和饲料中的游离脂肪酸或从甘油三酸脂衍生而来的脂肪酸都是有效的。但在等压溶剂系统中不能把十六烷酸与油酸的衍生物分离开来,这也是与气相色谱法相比较的不同之处。不过后来有人提出用梯度洗脱可以把上两种脂肪酸分离开。

    HPLC法还可以用示差折光检测器分离硬质小麦及软质小麦中含量不同的固醇软脂酸盐和固醇亚油酸盐,在多孔硅胶柱上分离,己烷/氯纺(9:1)作流动相。

5.HPLC在维生素分析中的应用

     维生素C是一种对人体十分重要但人体自身又不能合成的一类重要化合物。由于它具有抗坏血酸的生理功能,又名抗坏血酸,若严重缺乏会引起坏血病。维生素C还可参与体内氧化还原反应,具有解毒的作用。30年代时,维生素C就被广泛用于增加机体对传染病的抵抗力,近年的研究表明维生素C可预防癌症,并对肝炎、肝硬变有疗效。它可促进胶原蛋白抗体的形成,因胶原蛋白能包围癌细胞,维生素C具有抗癌作用,因它能参与神经介质、激素的生物合成,同时具有预防感冒、增强机体免疫力等功能。人体自身不能合成维生素C,必须从食物摄取。维生素C广泛存在于新鲜水果和蔬菜中,测定方法一般有比色法、荧光分光光度法、      化学滴定法等。由于上述方法操作烦琐,近年来多采用高效液相色谱法测定。

对于维生素的分析,除了个别几种维生素(维生素B6、B12和维生素H等)必须采用微生物法进行测定外,大多数维生素均可采用液相色谱法进行分析。水溶性维生素(B1、B2、C)的测定,将样品用酸消化后,用酶分解蛋白质,然后用溶剂提取出维生素,而脂溶性维生素(A、K、E)的测定则将食品进行皂化处理后,提取不皂化物,然后再从不皂化物中将维生素萃取出来,预处理后的两类维生素,通过液相色谱-紫外/可见检测器在各自所固有的波长条件下进行定量测定。高效液相色谱法根据不同的要求,所选择的固定相、流动相、流速、检测器和检测波长都不相同。多数方法采用荧光检测器、电化学检测器、紫外检测器或在检测中变换检测波长。李学梅测定保健食品中维生素C时,选用的色谱条件为EclipseXDB-C18 416mm×250mm 5μm柱、C18416mm×20mm 5μm预柱,流动相为甲醇:0102mol/L。

6HPLC在其他物质分析中的应用

6.1 HPLC在酸奶研究中的应用

    随着现代分析手段的不断更新,越来越多高灵敏度、高准确度的先进分析技术和方法被用于酸奶的分析检验。由于高效液相色谱(HPLC)具有快速、方便、分辨率高、分离效果好、重现性好等优点,可将其用于检测酸奶中富含的糖、脂、氨基酸、维生素等营养物质。原理是样品先经预处理后,进行液相色谱分析,HP柱用粒径为5~10μm的全多孔微粒担体作载体,将洗脱剂(流动相)以高压泵注入柱内,形成显著的压力降,样品组分迅速连续不断的在两相间进行反复多次平衡分配,以达到分离的目的,各组分流出顺序依其组分对两相间的相对亲和性。分离后的组分通过鉴定器产生讯号,经放大后在记录仪上绘出色谱峰。

6.2 HPLC法测定红葡萄酒中的白藜芦醇

     高效液相色谱法测定红葡萄酒中白藜芦醇及其甙的顺、反异构体,操作简单,精密度高,重复性好,可用于葡萄酒中白藜芦醇4种异构体的测定。众所周知,适量饮用红葡萄酒对健康极为有益白藜芦醇(resveratrol,简称RV)是红葡萄酒中发挥保护作用的主要功能因子。白藜芦醇的化学名为3,4’,5-三羟基二乙烯,在自然状态下,其3位羟基上的氢原子被一个葡萄糖分子取代形成了白藜芦醇甙(piceid,简称PD)。已有报道证实白藜芦醇具有抗炎、抗菌、抗氧化、调节脂代谢、抗凝血、调节雌激素作用及抗肿瘤等多种生物活性,因此葡萄酒(汁)中白藜芦醇含量的高低自然成为影响其保健功效的因素之一。

  采用高效液相色谱法(HPLC)测定白藜芦醇含量已有一些报道[。用高效液相色谱法测定水解前后顺、反式白藜芦醇含量的变化,从而计算出葡萄酒中白藜芦醇的4种异构体的含量。色谱柱为SymmetryC18柱(319 mm i.d.×150 mm),流动相为乙醇-0.05%乙酸水溶液(体积比为23∶77),紫外检测波长为306nm。其特点在于:采用阳光照射将白藜芦醇及其甙的反式异构体部分转化成顺式异构体;利用β-2葡萄糖苷酶将顺式及反式白藜芦醇甙中的β-2葡萄糖苷键水解成为相应的白藜芦醇异构体,从而解决了因葡萄酒中白藜芦醇甙峰与其他组分峰重叠而不能被直接测定的问题;通过测定酶水解前后葡萄酒(汁)中顺式、反式白藜芦醇含量的变化,计算出葡萄酒(汁)中白藜芦醇及其甙的顺、反异构体的含量。

6.3 HPLC法分析罗汉果中主要皂甙成分的研究

     罗汉果葫芦科罗汉果属多年生草质藤本植物的成熟果实,是我国传统的药用植物,临床上可用于治疗高血压、肺结核、哮喘、胃炎、百日咳、急慢性气管炎和急慢性扁桃腺炎等疾病。罗汉果的主要活性成分是葫芦素烷三萜类皂甙,关于罗汉果皂甙的分析,目前普遍应用的是香草醛-硫酸比色法和香草醛-高氯酸比色法测定总皂甙含量,但分光光度法的稳定性及专属性差。H.C.Makapugay等建立的高效液相分析方法,仅能分析罗汉果甙V,不能分离分析其他皂甙组。张云竹等建立一种快速高效的高压液相分析方法,对罗汉果中的主要皂甙成分进行测定。以C18柱为色谱柱,采用反相高效液相法分离分析罗汉果皂甙。结果建立了罗汉果皂甙的HPLC分析条件,其色谱条件为:流动相23%的乙腈水溶液;流速1ml/min;检测波长210nm;柱温为室温;灵敏度0.04AUFS。采用上述的液相分析方法分析四种罗汉果皂甙的含量,发现该方法简便、快速、准确、线性范围在0.5~13.75μg之间,且线性关系良好(R≥0.99),加标回收率高(94.46%~105.05%),精密度良好(RSD=1.40%~3.31%)。因此HPLC方法可用于分析罗汉果及其制品中的罗汉果皂甙含量。

6.4 HPLC法对N-亚硝胺的测定

    N-亚硝胺可诱发肝癌、结肠癌等。某些 N-亚硝胺化合物,如 N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺、N-亚硝基四氢吡咯等也是一类致癌物质。过去采用气相色谱法测定食物中挥发性亚硝胺,其中仅色谱测定一步便需耗时1h之多,而采用高效液相色谱法则只需要13min。

6.5 HPLC法对芳香胺的测定

   芳香胺在合成色素中应较多。当食品中色素添加过量时,对人体可造成害。因此芳香胺的分离测定在食品安全上也很重要。各种二胺异构体的分离测定可采用PermaphaseETH谱柱,移动相同甲醇-环戊烷(5∶95)。2,6-甲苯胺、2,3-二甲苯胺及苯胺的分离可用Durpakcarbowax400/Corasil,淋洗液为异丙醇-已烷(10∶90)。硝基苯胺异构体的分离用Vydac吸附剂,用已烷-A(1∶1)作淋洗液。按邻、对间位顺序冲出,分离时间为3min~18min。

6.6 HPLC法对黄曲霉毒素的测定

    黄曲霉毒素是黄曲霉菌类所产生的代谢产物。各种发霉的食物如花生、大米、玉米等,都可能遭此种毒素污染。现已确定黄曲霉毒素有B1、B2、B2a、G1、G2、G2a、M1、M2等 8种结构的类似物。这些毒素毒性极强,在实验动物身上几个微克便能诱致肝癌的发生。高效液相色谱法分离测定黄曲霉毒素,可采用Sli-X-Ⅱ,室温下A-异辛烷淋洗,B1、B2、G1、G2依次冲出,分析时间约7min。如PermaphaseETH,2-丙醇-水(3∶97)则以G1、B2、G2、B1次序冲出。由于黄曲霉毒素在254纳米吸收很强,因此可检测出10-9。此外,此毒素还能产生荧光,应用荧光检测器则检出灵敏度可更高。

7.结语

    高效液相色谱法只要求样品能制成溶液,不受样品挥发性的限制,流动相可选择的范围宽,固定相的种类繁多,因而可以分离热不稳定和非挥发性的离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。与试样预处理技术相配合,HPLC所达到的高分辨率和高灵敏度,使分离和同时测定性质上十分相近的物质成为可能,能够分离复杂相体中的微量成分。随着固定相的发展,有可能在充分保持生化物质活性的条件下完成其分离。由于高压输液泵的使用,相对于经典液相色谱,其分析时间大大缩短,当输液压力增加时,流动相流速会加快,完成一个样品的分析时间仅需几分钟到几十分钟。因此,高效液相色谱技术在食品分析领域具有巨大的现实意义。