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液相色谱-串联质谱法测定尿液中的内源性类固醇激素

* 来源: 无锡赛那尔 * 作者: sainaer * 发表时间: 2018-12-17 8:50:37
摘要:建立了液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定尿液中的内源性类固醇激素的方法。尿样经葡萄糖醛酸甙酶酶解后进行液-液提取,以甲醇-0.1%甲酸缓冲液(含0.02mol/L乙酸铵)(体积比为68∶32)为流动相,采用Cosmosil C18色谱柱分离,并以三重四极杆串联质谱多反应监测扫描方式对尿样中的脱氢表雄酮(DHEA)、睾酮、表睾酮、雄酮和苯胆烷醇酮等5种激素进行检测。方法的最低检出限为0.01~10ng/mL,平均回收率为96.7%~106.5%,日内和日间相对标准偏差(RSD)分别小于7%和11%。应用所建立的方法测定了健康志愿者口服DHEA后尿液中内源性类固醇激素的变化情况,结果表明该方法样品处理简便,色谱分离完全,结果准确可靠,可替代气相色谱-质谱法用于体液中内源性类固醇激素兴奋剂的常规分析。
 
1.样品收集
健康志愿者6名,其中男性3名,女性3名。志愿者受试前留取空白尿液; 口服120 mg DHE****剂后,再收集0~24 h的尿液,于-20℃下保存。
 
2.样品处理
取尿液210 mL于试管中,加入5 ng甲基睾酮(内标)及210 mL pH6.8的磷酸缓冲液、150 μL β-葡萄糖醛酸甙酶(3 000 U),于80℃恒温水浴中培养3 h,取出后冷却至室温。再加入3.5 mL******,混旋,离心,取出有机相并于60℃水浴中挥干,残渣中加入100 μL 流动相溶解,供LC-MS/MS分析。
 
3.色谱及质谱条件
液相色谱:采用Cosmosil C18色谱柱(150 mm×2 mm,5μm )和Phenom enex C18预保护柱。流动相为甲醇-0.1%甲酸缓冲液(含0.02 mol/L乙酸铵) (体积比为68∶32) , 流速为200 μL/min。进样量为5 μL。
 
串联质谱:采用电喷雾电离源( ES I) ,在多反应监测(MRM )正离子模式下扫描。碰撞气(CAD )压力为48 263 Pa;气帘气(CUR)压力为68 948 Pa;雾化气(GS1)压力为241 317 Pa;辅助加热气(GS2)压力为275 790 Pa。喷雾电压为5 500 V;离子化温度( TEM )为500 ℃。