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高效液相色谱法监测环孢素A的全血浓度

* 来源 : 无锡赛那尔 * 作者 : sainaer * 发表时间 : 2018-12-26

【摘要】  目的:建立高效液相色谱法测定环孢素A全血浓度的方法。方法:采用Spherisorb C 8(150 mm×4.6 mm,5 μm)分析柱,流动相为甲醇∶水(75∶25,V/V),检测波长214 nm,流速1 ml/min,柱温为60 ℃。结果:环孢素A浓度在50 ng/ml~2 000 ng/ml范围内线性良好(r=0.999 8),平均方法回收率为99.7%,日内及日间精密度<6% (n=5)。结论:本方法简便、准确、可靠,能较好的满足临床血药浓度监测的需要。

【关键词】  环孢素A;高效液相色谱法;血药浓度监测


  Hplc Determination of Cyclosporin A in Whole Blood

  Abstract:Objective To establish a HPLC method for the determination of cyclosporin A in whole blood.Methods The Spherisorb C 8 column(150 mm×4.6 mm,5 μm)was used,the mobile phase was methanol�water(75:25, V/V),the detection wavelength was at 214 nm,the flow rate was 1 ml/min and column temperature was 60 ℃.Results The linear range of cyclosporin A was 50 ng/ml~2 000 ng/ml(r=0.999 8). The average recovery was 99.7%(n=5). Within�day and between�day variation co�efficients were less than 6%.Conclusion The method is simple, accurate,and reliable.It is suitable for therapeutic drug monitoring.

  Key words:Cyclosporin A;HPLC;Therapeutic durg monitoring

  环孢素A(Cyclosporin A,CsA)是一种强效的免疫抑制剂,目前广泛应用于器官移植术后的抗排异反应。环孢素A治疗窗窄,个体差异大,用药时间长,保持适宜的血药浓度至关重要。CsA的血药浓度过高易引起肝、肾及中枢神经系统损害和感染;过低则发生排斥反应和诱发自身免疫性疾病,其肾毒性反应与肾移植术后发生的排异反应难以区别[1]。因此为提高CsA用药的安全性和有效性,必须在其治疗过程中定期监测血药浓度,并调整给药剂量[2]。我们用高效液相色谱法对器官移植患者术后CsA的全血浓度进行监测,并参考文献,对全血处理方法进行了研究和改进,使其能较好地满足临床的需要。

  1  材料与方法

  1.1  仪器与试剂  美国Waters系列高效液相色谱仪(包括1525二元泵、2487紫外检测器、柱温箱、Breeze色谱工作站);FA2004型电子天平(上海天平仪器厂);L�128B型试管氮吹浓缩仪、L�119型试管恒温加热仪(北京来亨科贸有限责任公司技术开发中心) ;YKH�Ⅱ型液体快速混合器(江西医疗器械厂) ;LG10�2.4A型离心机(北京医用离心机厂) 。CsA标准品由中国药品生物制品检定所提供,批号:130495�200202,含量98.8%;CsD对照品由华北制药集团提供,含量99.5%;甲醇为色谱纯、钨酸钠、******、正己烷均为分析纯。CsA贮备液:精密称取CsA标准品20 mg,加甲醇溶解并定容至100 ml,得200 μg/ml的 CsA储备液。CsA标准液:精密量取CsA贮备液5 ml,分别用甲醇稀释至50 ml和200 ml,得20 μg/ml和5 μg/ml的CsA标准液。内标工作液:精密称取CsD 36 mg,加甲醇溶解并定容至100 ml,从中精密量取10 ml,加甲醇稀释至100 ml,得36 μg/ml的内标工作液。上述溶液均置4 ℃冰箱保存。

  1.2  色谱条件  色谱柱为Spherisorb C8柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),大连依利特分析仪器有限公司提供;流动相为甲醇∶水(75∶25,V/V);流速1 ml/min;检测波长214 nm;柱温60 ℃;灵敏度:0.100 0AUFS。

  1.3  血样处理方法  取全血0.5 ml,精密加入内标工作液10 μl,涡旋30 s;加0.1 mol/L NaOH溶液(内含2%钨酸钠)1 ml,涡旋30 s;加重蒸******5 ml,涡旋提取2 min,4 000 r/min离心10 min;分离******层,于40 ℃试管恒温加热仪上氮气吹干,残渣加甲醇-10 mmol/L盐酸(3:1)溶液80 μl溶解,涡旋30 s;加正己烷300 μl, 涡旋30 s,3 000 r/min离心10 min,取下清液10 μl进样。

  2  结果

  2.1  色谱行为  在上述色谱条件下,色谱分离情况见图2,CsA、CsD保留时间分别为9.0 min 和10.8 min。可见CsA和CsD色谱峰分离完全,峰形良好,全血中内源性物质不干扰CsA的测定。

  图1  空白血样(略)

  图2  样品血样  1 CsA  2 CsD(略)

  2.2  线性关系及检测限  取空白全血0.5 ml,分别加入内标工作液10 μl及CsA标准液适量,使CsA浓度分别为50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ ml、400 ng/ ml、800 ng/ ml、1 200 ng/ml、1 600 ng/ml、2 000 ng/ml,按“1.3”项下方法处理后进样,以CsA与内标峰面积比(X)对CsA血药浓度(Y)作回归分析,得回归方程Y=664.2X-28.1(r=0.9998,n=8),表明CsA全血浓度在50 ng/ml~2 000 ng/ml范围内线性关系良好。以信噪比S/N≥3计算, CsA最低检测浓度为15 ng/ml。

 2.3  精密度  配制CsA浓度分别为100 ng/ml、400 ng/ml、1 200 ng/ml的标准血样,按“1.3”项下方法处理后进样,进行日内、日间精密度测定,结果见表1。

  表1  精密度结果(略)

  2.4  回收率  分别以全血配制100 ng/ml、400 ng/ml、1 200 ng/ml 3个浓度,每一浓度制备5份,测定其回收率,结果见表2。

  表2  回收率结果(略)

  3  讨论

  3.1  测定方法  目前国内外测定全血中CsA的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、荧光偏振免疫法(FPIA)、高效毛细管电泳法(HPCE)、放射免疫法(RIA)等。虽然FPIA法检测快速、灵敏、准确,但其使用的试剂盒价格昂贵,测定成本高,尤其在样本数少的情况下易造成较大的浪费。而HPLC法分离效果好,特异性强,其测定结果不受代谢物的影响,与药理效应之间具有良好的量效关系,测定成本也相对低廉[3]。

  3.2  全血样品的处理方法  因CsA 41%~57%存在于红细胞中,一般先加碱使红细胞破裂游离出其中的CsA,再用有机溶剂萃取。萃取方法分单步和多步萃取法,也有采用SPE固相萃取柱萃取的方法[4]。多步萃取法国内外报道最多,单步萃取法和固相萃取法研究和应用相对较少,但经过优化实验条件后,单步萃取法较其他两种方法具有操作简便、省时、实验成本低的优点。

  3.3  处理过程  本方法直接利用强碱去除大部分内源性杂质,再经正己烷进一步除去脂溶性干扰物后进样,简化了操作。全血碱化后用******提取时发现易产生乳化现象,经调整了水相和有机相的比例(减少碱的用量)并在NaOH溶液中加入2%钨酸钠后,乳化现象基本消除[5]。******重蒸后可以消除其中过氧化物对色谱图产生的干扰[6]。在用正己烷脱脂前先以流动相溶解残渣时出现混浊,且进样后色谱图中有杂峰干扰,而用甲醇溶解后有更多的干扰峰,最后选择以接近流动相的甲醇�10 mmol/L盐酸(3:1)溶液完全溶解残渣,再经正己烷脱脂后进样,结果取得较好效果[7]。

  3.4  流动相采用甲醇∶水(75∶25,V/V),简单经济,毒性小;使用C 8柱,柱温控制在60 ℃,可实现样品峰与内标峰分离良好,有利于延长色谱柱的寿命,降低测定成本。本方法操作简便,测定结果准确,提取回收率>70%,检测限、线性及精密度等均符合临床血药浓度监测的要求。

  3.5  我院临床药学室自2002年起在肝、肾移植术后患者中,用HPLC法监测CsA血药浓度已达4 000余例,目前以监测CsA峰浓度(C 2)为主。因为C 2在预测、判断是否发生排斥反应、尤其是有无肝肾毒性方面明显优于CsA谷浓度(CO),系统、连续地监测CsA血药浓度对临床工作具有重要意义。随着移植肾存活时间的延长,CsA治疗浓度水平逐渐下降,C0从术后的400 ng/ml左右降至两年后的150 ng/ml左右,C 2从术后的1 000 ng/ml以上降至2年后的600 ng/ml左右。CsA个体差异大,体内过程的影响因素很多,除了定期进行血药浓度监测,临床应用时还应根据肝肾功能、特殊检测及其他实验室检查结果,结合患者的实际情况作综合分析,及时调整治疗方案,实现个体化给药,从而提高CsA用药的有效性和安全性。

 

【参考文献】
    [1] Morr S,Stacey M.Resuscitation in pregnancy[J].BMJ,2003,327:1277�1279.

  [2] 王莉,杨宇如,卢一平,等.环孢素A血药浓度监测的临床意义[J].现代泌尿外科杂志,2000,5(02):89�97.

  [3] 陈锦珊,杜青云.全血中环孢素A药物浓度监测方法评价及其临床意义[J].中国医院药学杂志,2004,24(08):486�487.

  [4] 李楚云,徐振文,谢展雄.高效液相色谱法固相萃取测定全血环孢素A浓度[J].中国医院药学杂志,2003,23(05):281�283.

  [5] 李海菊,杨娟,王峰,等.RP�HPLC 测定全血中环孢素A[J].中国药学杂志,2005,40(11):857�859.

  [6] 丁俊杰,李中东,焦正,等.人全血中环孢素A浓度的HPLC测定及药物动力学研究[J].中国医药工业杂志,2004,35(02):91�93.

  [7] 道毅俊,仲珑瑾,李中东,等.环孢素A胶囊人体生物利用度及生物等效性研究[J].中国医药工业杂志,2006,37(11):749�751.